Tämä ensimmäinen liskon geenimanipulaatiotapaus on luonut malliorganismin, joka voisi auttaa ymmärtämään paremmin matelijoiden evoluutiota ja kehitystä
CRISPR-Cas9 tai yksinkertaisesti CRISPR on ainutlaatuinen, nopea ja edullinen geeni muokkaustyökalu, joka mahdollistaa genomin muokkaamisen poistamalla, lisäämällä tai muuttamalla DNA. CRISPR-lyhenne tulee sanoista "Clustered Regularly Inter-Spaced Palindromic Repeats". Tämä työkalu on yksinkertainen ja tarkempi kuin aiemmat muokkausmenetelmät DNA.
CRISPR-Cas9-työkalu ruiskuttaa tsygoottivaiheessa oleviin organismeihin (a) Cas9-entsyymistä valmistettua DNA-rakennetta, joka toimii "saksina" ja voi leikata tai poistaa osan DNA:sta, (b) ohjaa RNA:ta – sekvenssiä, joka sopii kohdegeeniin ja ohjaa siten Cas9-entsyymin kohdesijaintiin. Kun DNA:n kohdeosa on leikattu, solun DNA-korjauskoneisto liittyy uudelleen jäljellä olevaan juosteeseen ja hiljentää samalla kohteena olevan geenin. Tai geeni voitaisiin "korjata" käyttämällä uutta modifioitua DNA-templaattia prosessissa, jota kutsutaan homologiaohjatuksi korjaukseksi. Siten CRISPR-Cas9-työkalu mahdollistaa geneettiset modifikaatiot ruiskeella geenien muokkaus liuokset yksisoluiseksi hedelmöitetyksi munasoluksi. Tämä prosessi aiheuttaa geneettisen muutoksen (mutaation) kaikissa myöhemmissä muodostuvissa soluissa, mikä vaikuttaa geenin toimintaan.
Vaikka CRISPR-Cas9:ää käytetään rutiininomaisesti monissa lajeissa, mukaan lukien kalat, linnut ja nisäkkäät, se ei ole toistaiseksi onnistunut matelijoiden geneettisessä manipulaatiossa. Tämä johtuu ensisijaisesti kahdesta esteestä. Ensinnäkin naarasmatelijat varastoivat siittiöitä pitkäkestoisesti munanjohtimiinsa, mikä tekee hedelmöitysajan tarkan määrittämisen vaikeaksi. Toiseksi matelijoiden munien fysiologiassa on monia ominaisuuksia, kuten taipuisat munankuoret, hauraus ilman ilmatilaa sisällä, mikä tekee alkioiden käsittelystä haastavaa aiheuttamatta repeämistä tai vaurioita.
Sivulle ladatussa artikkelissa bioRxiv 31. maaliskuuta 2019 tutkijat ovat raportoineet CRISPR-Cas9:n käyttötavan kehittämisestä ja testaamisesta geeninkäsittely matelijoilla ensimmäistä kertaa. Tutkimukseen valittu matelijalaji oli trooppinen lisko nimeltään Anolis sagrei tai yleisemmin ruskea anoli, joka on laajalle levinnyt Karibialla. Tutkimuksessa mukana olleet liskot kerättiin villiltä alueelta Floridasta, USA:sta. Tämä laji soveltuu ihanteellisesti tutkimukseen minikokonsa, pitkän pesimäkauden ja suhteellisen lyhyen kahden sukupolven välisen keskimääräisen ajan vuoksi.
Matelijoiden tällä hetkellä kohtaamien rajoitusten voittamiseksi tutkijat mikroinjektoivat CRISPR-komponentteja epäkypsiin hedelmöittämättömiin muniin, kun munat olivat vielä naarasliskojen munasarjoissa ennen hedelmöitystä. He kohdistuivat tyrosinaasigeeniin, joka tuottaa entsyymiä, joka säätelee liskojen ihon pigmentaatiota, ja jos tämä geeni poistetaan, lisko syntyisi albiinoksi. Tämä selkeä pigmentaatiofenotyyppi oli syy valita tyrosinaasigeeni. Mikroinjektoidut munat kypsyvät sitten naaraan sisällä ja ne hedelmöitetään sitten luonnollisesti urospuolisella tai varastoitulla siittiöllä.
Seurauksena oli, että muutamaa viikkoa myöhemmin syntyi neljä albiinoliskoa, mikä vahvisti, että geenityrosinaasi oli deaktivoitunut ja geeninkäsittely prosessi onnistui. Koska jälkeläiset sisälsivät muokatun geenin molemmilta vanhemmilta, oli selvää, että CRISPR-komponentit pysyivät aktiivisina paljon pidempään äidin epäkypsässä munasolussa ja hedelmöityksen jälkeen se mutatoi isän geenejä. Siten mutanttialbiinoliskoilla oli manipuloitua tyrosinaasia geeneissä, jotka perittiin sekä äidiltä että isältä, koska albinismi on molemmilta vanhemmilta peritty ominaisuus.
Tämä on ensimmäinen tutkimus, joka tuottaa tehokkaasti geneettisesti muunnettuja matelijoita. Tutkimus voisi toimia samalla tavalla muissa liskolajeissa, kuten käärmeissä, joiden osalta nykyiset lähestymistavat eivät ole tähän mennessä onnistuneet. Tämä työ voisi auttaa ymmärtämään paremmin matelijoiden evoluutiota ja kehitystä.
***
{Tämä tutkimus on tällä hetkellä lähetetty vertaisarviointiin. Voit lukea esipainetun version napsauttamalla alla olevaa DOI-linkkiä lainattujen lähteiden luettelossa}
Lähteet)
Rasys AM et ai. 2019. Preprint. CRISPR-Cas9 Geenimuokkaus Lizardsissa hedelmöittämättömien munasolujen mikroinjektiolla. bioRxiv. https://doi.org/10.1101/591446
